Como encontrar uma sequência parcial de cDNA

Os investigadores encontram seqüências parciais de cDNA por quimicamente quebrar cópias de uma molécula de DNA para criar uma matriz de fragmentos que diferem em comprimento por um de base. Neste processo, a base em um final de cada fragmento é ligado a um dos quatro corantes fluorescentes, a cor do corante em função da identidade da base nessa posição. Máquinas, em seguida, classificar os fragmentos rotulado de acordo com o tamanho. Finalmente, um laser excita o corante etiquetas uma a uma. O resultado é uma seqüência de cores que podem ser lidos eletronicamente e que corresponde à ordem das bases em uma das extremidades do DNA que está sendo analisado. Parcial centenas seqüências de bases de comprimento podem ser reunidas em um computador para produzir seqüências genéticas completas.

Uma vez que tenhamos feito um DNA, podemos copiá-lo para produzir tanto como nós queremos. Isso significa que teremos material suficiente para determinar a ordem de suas bases. Porque nós sabemos as regras que as células usam para ligar as seqüências de DNA em seqüências de aminoácidos que constituem as proteínas, a ordenação de bases nos diz que a seqüência de aminoácidos da correspondente fragmento de proteína. Essa seqüência, por sua vez, podem ser comparadas com as seqüências de proteínas cujas estruturas são conhecidas. Esta manobra muitas vezes nos diz algo sobre a função da proteína completa, porque as proteínas que contém seqüências similares de aminoácidos, muitas vezes executar tarefas semelhantes.

Analisando seqüências de DNA costumava ser extremamente demorado, mas nos últimos anos, instrumentos biomédicos têm sido desenvolvidos para que possam executar a tarefa de forma confiável e automaticamente. Outra evolução foi também necessário fazer a nossa estratégia viável. Seqüenciamento de equipamentos, quando operados na escala estávamos contemplando, produz quantidades enormes de dados. Felizmente, os sistemas de computador capaz de manipular o resultado megabytes estão agora disponíveis, e nós e outros têm escrito software que nos ajuda a dar sentido a essa riqueza de detalhe genético.

Montagem do Puzzle

Nossa técnica para identificar os genes usados por uma célula é analisar uma seqüência de 300 a 500 bases em uma extremidade de cada molécula do DNA. Estas seqüências de cDNA parcial atuar como marcadores para os genes e são muitas vezes referidos como etiquetas de seqüências expressas. Escolhemos este comprimento para o nosso parcial seqüências do DNA, porque é curto o suficiente para analisar com bastante rapidez, mas ainda há tempo suficiente para identificar um gene de forma inequívoca. Se uma molécula de DNA é como um artigo de um artigo, uma sequência parcial é como a primeira página do articleit pode identificar o artigo, e ainda nos dão uma idéia do que o artigo é sobre. Parcial seqüências de DNA, de igual modo, pode dizer-nos algo sobre o gene que lhes confere. Na HGS, que produzem cerca de um milhão de bases de dados da seqüência primas todos os dias.

Nosso método é bem sucedida: temos milhares de genes identificados, muitas das quais podem desempenhar um papel na doença. Outras empresas e pesquisadores acadêmicos também iniciaram programas para gerar seqüências parciais de cDNA.

HGS computadores de reconhecer muitas das sequências parciais nós produzimos como derivando de um dos pesquisadores genes já identificados por outros meios ou de um gene que temos já nos encontramos. Quando nós não podemos mandar atribuir uma seqüência de recém-gerado parcial de um gene conhecido, as coisas ficam mais interessantes. Nossos computadores, então, verificar através de nossas bases de dados, bem como bancos de dados públicos para ver se a nova seqüência de sobreposições parciais algo que alguém tenha registrado antes.

Quando encontramos uma clara sobreposição, podemos reunir as seqüências de sobreposição parcial em vez de alongamento segmentos chamados contigs. Contigs correspondem, então, a sequências incompletas podemos inferir a estar presente em algum lugar em um gene do pai. Este processo é um pouco análoga à pesca fora as frases "um meia-noite sombria, enquanto eu pensava "e" quando eu pondered, fraco e cansado / a. Durante muitos.. volume "e combiná-los em um fragmento reconhecível como parte de" de Edgar Allan Poe The Raven ".

Ao mesmo tempo, tentamos deduzir a função provável da proteína correspondente à seqüência parcial. Uma vez que temos previsto a estrutura da proteína, podemos classificá-lo de acordo com sua similaridade com as estruturas de proteínas conhecidas. Às vezes, encontramos uma correspondência com uma outra proteína Homo sapiens, mas muitas vezes percebemos um jogo com um a partir de uma bactéria, fungo, planta ou inseto: outros organismos produzir muitas proteínas com função semelhante aos dos sapienss Homo. Nossos computadores atualizar continuamente estas classificações provisórias.

Em 1994, por exemplo, previmos que os genes que contêm quatro contigs específicos, cada um deles produzem proteínas semelhantes aos conhecidos para corrigir as mutações no DNA de bactérias e leveduras. Porque os pesquisadores tinham aprendido que a falta de reparação de mutações pode causar câncer de cólon, começamos a trabalhar as seqüências faixa dos quatro genes. Quando um investigador proeminente do cancro do cólon, posteriormente, abordou-nos para obter ajuda na identificação de genes que podem causar illnesshe que já sabia sobre um tal genewe foram capazes de dizer-lhe que já estávamos trabalhando com três genes adicionais que possam estar envolvidos.

Pesquisas posteriores confirmou que as mutações em qualquer um dos quatro genes podem causar risco de vida cólon, ovário ou câncer endometrial. Tal como muitos como um em cada 200 pessoas na América do Norte e Europa carregar uma mutação em um desses genes de reparação de incompatibilidade, como são chamados. Sabendo disso, os cientistas podem desenvolver testes para avaliar a incompatibilidade de genes de reparo em pessoas que têm parentes com estes cancros. Se as pessoas que são testados mostrar uma pré-disposição genética para a doença, eles podem ser monitorados de perto. Detecção precoce de tumores podem levar a cirurgia de salvamento, e os testes já foram utilizados na investigação clínica para identificar pessoas em risco.

Nosso banco de dados já contém mais de um milhão de cDNA derivada sequências parciais de genes, classificado em 170.000 contigs. Globalmente, mais da metade dos novos genes que identificamos ter uma semelhança com genes conhecidos que foram atribuídos em função provável. Como o tempo passa, essa proporção tende a aumentar.

Se um tecido dá origem a um número invulgarmente elevado de seqüências de DNA que derivam do mesmo gene, que fornece uma indicação de que o gene em causa está a produzir grandes quantidades de mRNA. Isso geralmente acontece quando as células estão produzindo grandes quantidades da proteína correspondente, sugerindo que a proteína pode estar fazendo um trabalho particularmente vital. HGS também presta especial atenção aos genes que são expressos apenas em uma estreita faixa de tecido, porque esses genes têm mais probabilidade de ser útil para intervir em doenças que afetam os tecidos. Dos muitos genes que nós descobrimos, nós identificamos um percentual que parece mais provável de ser medicamente importantes.

New Genes, New Medicines

Usando a técnica de seqüência parcial do cDNA para a descoberta do gene, os pesquisadores têm pela primeira vez foi capaz de avaliar quantos genes são dedicados a cada uma das principais funções celulares, tais como a defesa, o metabolismo e assim por diante. O vasto estoque de informações exclusivas de seqüências parciais de cDNA oferece novas possibilidades para a ciência médica. Estas oportunidades estão sendo sistematicamente explorado.

Bancos de dados como o nosso já provaram o seu valor para encontrar as proteínas que são úteis como indicadores de doença. O cancro da próstata é um exemplo. Um teste usado para detectar câncer de próstata mede os níveis no sangue de uma proteína chamada antígeno específico da próstata. Os pacientes que têm câncer de próstata freqüentemente apresentam níveis anormalmente elevados. Tumores Infelizmente, de crescimento lento, relativamente benigna, bem como os tumores malignos que requerem terapia agressiva pode causar níveis elevados do antígeno, e assim que o teste é ambíguo.

HGS e seus parceiros têm analisado mRNAs de múltiplas amostras de tecido saudável da próstata, bem como de tumores benignos e malignos da próstata. Encontramos cerca de 300 genes que são expressos na próstata, mas em nenhum outro tecido, dos quais cerca de 100 são ativos apenas nos tumores de próstata, e cerca de 20 são expressas apenas em tumores avaliado por patologistas como maligno. Nós e nossos parceiros comerciais estão usando estes 20 genes e seus produtos de proteína para desenvolver testes para identificar a doença maligna da próstata. Temos um trabalho semelhante em curso para mama, pulmão, fígado e câncer de cérebro.

Bases de dados de seqüências de DNA parcial também pode ajudar a encontrar os genes responsáveis por doenças raras. Os investigadores têm sabido por muito tempo, por exemplo, que uma certa forma de cegueira em crianças é o resultado de um defeito herdado na decomposição química do açúcar galactose. Uma pesquisa do nosso banco de dados revelou dois genes previamente desconhecido Homo sapiens cujas proteínas correspondentes estava previsto para ser estruturalmente semelhante à galactose conhecidas enzimas de metabolização de leveduras e bactérias. Investigadores rapidamente confirmou que herdaram defeitos em um desses dois genes causam este tipo de cegueira. No futuro, as enzimas e os genes em si pode ser usado para evitar a aflição.

Parcial seqüências de DNA são também estabelece um recorde impressionante para ajudar os investigadores a encontrar moléculas menores que são candidatos a novos tratamentos. Métodos para criar e testar drugsthe pequenas moléculas mais comum typehave melhorou dramaticamente nos últimos anos. Equipamentos automatizados podem rapidamente tela de compostos naturais e sintéticos para a sua capacidade de afetar um Homo sapiens de proteínas envolvidas na doença, mas o número reduzido de metas proteína conhecida atrasou o progresso. Quanto mais Homo sapiens proteínas são investigadas, o progresso deve acelerar. Nosso trabalho agora está fornecendo mais de metade das ligações SmithKline Beecham para os produtos em potencial.

Bases de dados como o nosso, não só facilitam a tela moléculas aleatoriamente para a atividade útil. Conhecer a estrutura de uma proteína permite cientistas de drogas design personalizado para interagir de forma específica com a proteína. Esta técnica, conhecida como a concepção racional de medicamentos, foi usado para criar alguns dos novos inibidores da protease, que são eficazes contra o HIV (apesar de nosso banco de dados não estava envolvido nesse esforço particular). Estamos confiantes de que as seqüências parciais de cDNA permitirá farmacologistas a fazer mais uso do desenho racional de medicamentos.

Um exemplo de como nosso banco de dados já provou ser útil preocupações células conhecidas como osteoclastos, que estão normalmente presentes no osso, essas células produzem uma enzima capaz de degradar o tecido ósseo. A enzima parece ser produzido em excesso em alguns estados da doença, tais como osteoartrite e osteoporose. Nós encontramos em nossos computadores, uma seqüência de um gene expresso em osteoclastos que apareceu para codificar a enzima destruidora; sua seqüência era semelhante ao de um gene conhecido por dar origem a uma enzima que degrada a cartilagem. Nós confirmamos que o gene osteoclastos foi responsável pela enzima de degradação e também mostrou que não é expresso em outros tecidos. Essas descobertas significava que poderia inventar maneiras de impedir a proteína do gene sem se preocupar com que os métodos de lesar outros tecidos. Nós fizemos então a proteína, e SmithKline Beecham tem usado para identificar possíveis terapias por uma combinação de seleção de alto rendimento e desenho racional de medicamentos. A empresa também nosso banco de dados utilizado para triagem de moléculas que podem ser usados para tratar a arteriosclerose.

Um filão extremamente rica de genes e proteínas, a partir de um ponto de vista médico, é uma classe conhecida como G-receptores acoplados à proteína. Estas proteínas span membrana externa da célula e transmitir sinais biológicos de outras células para o interior da célula. É provável que as drogas capazes de inibir tais receptores vital poderia ser usada para tratar doenças tão diversas como a hipertensão, úlceras, enxaqueca, asma, distúrbios do resfriado comum e psiquiátricos. HGS encontrou mais de 70 G novos receptores acoplados à proteína. Estamos agora a testar os seus efeitos através da introdução de genes do receptor que descobrimos em células e avaliar como as células que produzem as proteínas codificadas responder a vários estímulos. Dois genes que são de especial interesse para produzir proteínas que parecem estar particularmente envolvidas na hipertensão e diabetes em adulto-início. Nossos parceiros da indústria farmacêutica estão à procura de pequenas moléculas que deve inibir os sinais biológicos transmitidos por esses receptores.

Last but not least, a pesquisa apóia a nossa crença de que alguns dos genes do Homo sapiens e as proteínas que estão descobrindo agora que, talvez em forma modificada, se constituem novas terapias. Muitas proteínas do Homo sapiens já são usadas como medicamentos, insulina e fator de coagulação para hemofílicos são exemplos bem conhecidos. Proteínas que estimulam a produção de células de sangue também são usados para acelerar a recuperação dos pacientes da quimioterapia.

As proteínas de cerca de 200 do gene da longa-metragem seqüências HGS revelou ter possíveis aplicações como medicamentos. Fizemos a maior parte destas proteínas e instituíram os testes de sua atividade nas células. Alguns deles também estão se mostrando promissores em testes com animais experimentais. As proteínas incluem várias quimiocinas, moléculas que estimulam as células do sistema imunológico.

Desenvolvimento de produtos farmacêuticos nunca será um processo rápido, porque os medicamentos, independentemente de proteínas, genes e moléculas pequenas, têm de ser amplamente testado. Entanto, parcial seqüências de DNA pode acelerar a descoberta de terapias candidatos. HGS permite o acesso aos investigadores universitários que grande parte do seu banco de dados, apesar de pedir um acordo de repartição de royalties de qualquer produto que se seguiu.

A utilização sistemática de métodos automatizados e informatizados da descoberta do gene produziu, pela primeira vez, um panorama global de onde os genes são diferentes anatomia expressedthe expressão genética do Homo sapiens. Além disso, estamos começando a aprender sobre as mudanças na expressão de gene na doença. É muito cedo para saber exatamente quando os médicos primeiro sucesso usar esse conhecimento para tratar a doença. Nossas análises prever, no entanto, que uma série de terapias que formarão pilares da medicina do século 21.

um artigo submetido por Donis F.

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