Come trovare una sequenza parziale cDNA

I ricercatori a trovare parziale sequenze di cDNA da chimicamente abbattere le copie di una molecola di cDNA per creare una serie di frammenti che differiscono in lunghezza da una base. In questo processo, la base a una fine di ogni frammento è collegato ad uno dei quattro tinture fluorescenti, il colore della tintura a seconda della identità della base in quella posizione. Macchine per poi ordinare i frammenti etichettati in base alle dimensioni. Infine, un laser eccita il colorante etichette uno per uno. Il risultato è una sequenza di colori che possono essere letti elettronicamente e che corrisponde alla fine delle basi ad una estremità del cDNA da analizzare. Sequenze parziali di centinaia di basi di lunghezza possono essere messi insieme in un computer per produrre sequenze di geni completa.

Una volta che abbiamo fatto un cDNA, siamo in grado di copiarlo a produrre quanto vogliamo. Ciò significa che avremo abbastanza materiale per determinare l'ordine delle sue basi. Perché sappiamo che la normativa che le cellule utilizzano per attivare sequenze di DNA in sequenze di amminoacidi che costituiscono le proteine, l'ordinamento delle basi ci dice che la sequenza aminoacidica del corrispondente proteine frammento. Quella sequenza, a sua volta, può essere confrontato con le sequenze di proteine le cui strutture sono noti. Questa manovra spesso ci dice qualcosa sulla funzione della proteina completa, in quanto le proteine contenenti sequenze simili di aminoacidi spesso svolgere compiti simili.

Analizzando le sequenze di cDNA usato per essere estremamente laborioso, ma negli ultimi anni strumenti biomedici sono stati sviluppati in grado di eseguire il compito in modo affidabile e automatico. Un altro sviluppo è stato anche necessario per rendere la nostra strategia praticabile. Sequenziamento attrezzature, se utilizzati su scala stavamo pensando, produce quantità gigantesca di dati. Fortunatamente, i sistemi informatici capaci di gestire la megabyte risultanti sono ora disponibili, e noi e gli altri hanno scritto il software che ci aiuta a dare un senso a questa ricchezza di dettagli genetici.

Assemblaggio del Puzzle

La nostra tecnica per identificare i geni utilizzati da una cellula è quello di analizzare una sequenza da 300 a 500 basi a una fine di ogni molecola del DNA. Queste sequenze di cDNA parziale agire come marcatori per i geni e sono a volte di cui al tag sequenza come espressi. Abbiamo scelto questa lunghezza per i nostri parziali sequenze di cDNA perché è abbastanza breve per analizzare abbastanza velocemente, ma ancora abbastanza a lungo per identificare un gene in modo inequivocabile. Se una molecola di cDNA è come un articolo da un articolo, una sequenza parziale è come la prima pagina del articleit in grado di identificare l'articolo e anche darci un'idea di ciò che l'articolo è di circa. Parziali sequenze di cDNA, allo stesso modo, può dirci qualcosa circa il gene che derivano da. A HGS, produciamo circa un milione di basi di dati grezzi sequenza di ogni giorno.

Il nostro metodo si sta rivelando di successo: abbiamo individuato migliaia di geni, molti dei quali possono svolgere un ruolo nella malattia. Altre aziende ed i ricercatori universitari hanno anche avviato un programma per generare sequenze di cDNA parziale.

Computer HGS di riconoscere molte delle sequenze parziali di nostra produzione come derivante da uno dei geni i ricercatori hanno già identificato in altro modo o da un gene che abbiamo precedentemente trovato noi stessi. Quando non possiamo sicuramente assegnare una sequenza appena generato parziale di un gene noto, le cose si fanno più interessanti. I nostri computer quindi eseguire la scansione attraverso il nostro database, nonché banche dati pubbliche per vedere se la nuova sequenza parziale sovrapposizione qualcosa a qualcuno è registrato prima.

Quando troviamo una chiara sovrapposizione, noi mettere insieme le sequenze parziali sovrapposizioni in sempre allungamento segmenti chiamati contigs. Contigs corrispondono, quindi, a sequenze incomplete si deduce di essere presenti da qualche parte in un gene genitore. Questo processo è in qualche modo analogo alla pesca le frasi "un mezzanotte tetra, mentre ho meditato "e", mentre riflettevo, debole e stanco / a. Più di molti.. volume "e la loro rielaborazione in un frammento riconoscibile come parte di Edgar Allan Poe" The Raven ".

Allo stesso tempo, si cerca di dedurre la probabile funzione della proteina corrispondente alla sequenza parziale. Una volta che abbiamo previsto la struttura della proteina, si classificano in base alla sua somiglianza con le strutture di proteine note. A volte troviamo una corrispondenza con un'altra proteina Homo sapiens, ma spesso notiamo una partita con uno da un batterio, fungo, vegetali o insetti: gli altri organismi di produrre molte proteine simili a quelle in funzione di sapienss Homo. I nostri computer continuamente aggiornare queste classifiche provvisorie.

Nel 1994, ad esempio, abbiamo previsto che i geni che contengono quattro contigs specifici sarebbe ciascuna produrre proteine simili a quelle conosciute per correggere le mutazioni nel DNA di batteri e lieviti. Perché i ricercatori hanno imparato che la mancata riparazione mutazioni possono causare il cancro del colon, abbiamo iniziato a lavorare le sequenze completo dei quattro geni. Quando un importante ricercatore del tumore del colon in seguito si avvicinò a noi per contribuire ad individuare i geni che potrebbero causare tale illnesshe sapeva già circa un genewe quali sono stati in grado di dirgli che stavamo già lavorando con tre geni supplementari che potrebbero essere coinvolti.

Una ricerca successiva ha confermato che le mutazioni in uno qualsiasi dei quattro geni può provocare pericolose per la vita del colon, dell'ovaio o carcinoma dell'endometrio. Come molti di uno ogni 200 persone in Nord America e in Europa portano una mutazione in uno di questi geni mismatch repair, come vengono chiamati. Sapendo questo, gli scienziati possono sviluppare test per valutare i geni di riparazione mismatch in persone che hanno parenti con questi tipi di cancro. Se le persone che vengono testati visualizzare una predisposizione genetica alla malattia, possono essere attentamente monitorati. Una rapida individuazione dei tumori può portare a un intervento chirurgico salvavita, e questi test sono già stati utilizzati nella ricerca clinica per identificare le persone a rischio.

Il nostro database contiene ora più di un milione di cDNA derivati da sequenze parziali di geni, ordinati in 170.000 contigs. Nel complesso, più della metà dei nuovi geni che identificano una somiglianza con geni noti che è stata assegnata una funzione probabile. Col passare del tempo, questa percentuale è destinata ad aumentare.

Se un tessuto dà luogo ad un numero insolitamente elevato di sequenze di cDNA che derivano da uno stesso gene, fornisce una indicazione del fatto che il gene in questione produce grandi quantità di mRNA. Che in genere accade quando le cellule producono grandi quantità della proteina corrispondente, suggerendo che la proteina può essere fatto un lavoro particolarmente vitale. HGS presta inoltre particolare attenzione ai geni che sono espressi solo in una ristretta gamma di tessuti, in quanto tali geni hanno più probabilità di essere utile per intervenire in malattie che colpiscono questi tessuti. Dei numerosi geni che abbiamo scoperto, abbiamo identificato una percentuale che sembrano particolarmente suscettibili di essere clinicamente importante.

Nuovi geni, nuovi farmaci

Utilizzando la tecnica parziale sequenza di cDNA per la scoperta del gene, i ricercatori hanno per la prima volta in grado di valutare come molti geni sono dedicate a ciascuna delle principali funzioni cellulari, come la difesa, il metabolismo e così via. L'archivio di parte delle informazioni univoche da parziali sequenze di cDNA offre nuove possibilità per la scienza medica. Queste opportunità sono ora sistematicamente esplorati.

Banche dati come il nostro, hanno già dimostrato il loro valore per la ricerca di proteine che sono utili come indicazioni della malattia. Il cancro alla prostata è un esempio. Un test ampiamente utilizzato per rilevare il cancro alla prostata misura i livelli nel sangue di una proteina chiamata antigene specifico della prostata. I pazienti che hanno il cancro alla prostata spesso mostrano livelli insolitamente alti. Purtroppo i tumori, una crescita lenta, relativamente benigno come pure i tumori maligni che richiedono una terapia aggressiva può causare elevati livelli di antigene, e quindi il test è ambigua.

HGS ei suoi partner hanno analizzato campioni di mRNA da più di tessuto prostatico sano così come da tumori benigni e maligni della prostata. Abbiamo trovato circa 300 geni che sono espressi nella prostata, ma in nessun altro tessuto, di questi, circa 100 sono attive solo nei tumori della prostata, e circa 20 sono espressi solo in tumori valutato da patologi come maligni. Noi ei nostri partner commerciali utilizzano questi 20 geni e dei loro prodotti proteici per elaborare le prove per individuare le malattie maligne alla prostata. Abbiamo un lavoro simile in corso per il seno, polmone, fegato e di tumori al cervello.

Banche dati di sequenze di cDNA parziale può anche aiutare a trovare i geni responsabili di malattie rare. I ricercatori sanno da molto tempo, per esempio, che una certa forma di cecità nei bambini è il risultato di un difetto ereditario nella ripartizione chimica del galattosio zucchero. Una ricerca della nostra banca dati, hanno rivelato due geni precedentemente sconosciute Homo sapiens cui le proteine corrispondenti sono stati previsti per essere strutturalmente simile al galattosio nota-enzimi che metabolizzano in lieviti e batteri. Investigatori rapidamente confermato che i difetti ereditati in uno di questi due geni che causano questo tipo di cecità. In futuro, gli enzimi o dei geni stessi potrebbe essere usato per prevenire il dolore.

Parziali sequenze di cDNA sono inoltre istituisce un impressionante record per aiutare i ricercatori a trovare molecole più piccole che sono candidati ad essere i nuovi trattamenti. Metodi per la creazione e la sperimentazione drugsthe piccole molecole-più comuni typehave migliorata drasticamente negli ultimi anni. Apparecchi automatici possono rapidamente schermo composti naturali e sintetici per la loro capacità di incidere un Homo sapiens di proteine coinvolte nella malattia, ma il numero limitato di obiettivi proteina nota ha ritardato il progresso. Come più proteine di Homo sapiens si indaga, il progresso deve accelerare. Il nostro lavoro è ora che forniscono oltre la metà della porta SmithKline Beecham per i prodotti potenziali.

Basi di dati come la nostra non solo rendono più facile la schermata di molecole utili per l'attività in modo casuale. Conoscere la struttura di una proteina consente agli scienziati di progettazione personalizzata di farmaci per interagire in modo specifico con la proteina. Questa tecnica, conosciuta come drug design razionale, è stata utilizzata per creare alcuni dei nuovi inibitori della proteasi, che si stanno dimostrando efficaci contro l'HIV (anche se il nostro database non è stato coinvolto in questo sforzo particolare). Siamo fiduciosi che le sequenze parziali di cDNA farmacologi permetterà di fare un uso più razionale della progettazione di farmaci.

Un esempio di come il nostro database è già dimostrata utile riguarda le cellule conosciute come osteoclasti, che sono normalmente presenti nel tessuto osseo, queste cellule producono un enzima in grado di tessuto osseo degradanti. L'enzima sembra essere prodotti in eccesso in alcuni stati di malattia, come l'artrosi e l'osteoporosi. Abbiamo trovato nel nostro computer una sequenza di un gene espresso in osteoclasti che sembrava il codice per l'enzima distruttiva, la sua sequenza è stata simile a quella di un gene noto a dar luogo ad un enzima che degrada la cartilagine. Abbiamo confermato che il gene osteoclasti era responsabile per l'enzima di degradazione e ha anche mostrato che non è espresso in altri tessuti. Quelle scoperte significa che abbiamo potuto inventare modi per contrastare il gene della proteina senza preoccuparsi che i metodi di danneggerebbe gli altri tessuti. Abbiamo poi fatto la proteina, e la SmithKline Beecham l'ha usata per identificare le possibili terapie da una combinazione di screening di alta throughput e lo sviluppo di farmaci razionale. La società ha inoltre utilizzato il nostro database per schermo per le molecole che potrebbero essere usati per trattare l'aterosclerosi.

Una lode estremamente ricco di geni e proteine, da un punto di vista medico, è una classe noto come G-proteine recettori accoppiati. Queste proteine span membrana esterna della cellula e trasmettere segnali biologici da altre cellule nell'interno della cellula. È probabile che i farmaci in grado di inibire tali recettori vitale potrebbe essere usato per trattare malattie diverse come l'ipertensione, ulcera, emicrania, asma, disturbi del comune raffreddore e psichiatriche. HGS ha trovato più di 70 nuovi G-proteine recettori accoppiati. Stiamo ora sperimentando i loro effetti con l'introduzione di geni recettori abbiamo scoperto nelle cellule e valutare come le cellule che compongono le proteine codificate rispondere a stimoli diversi. Due geni che sono di particolare interesse la produzione di proteine che sembrano essere criticamente coinvolti nel trattamento dell'ipertensione e nel diabete dell'adulto. I nostri partner nel settore farmaceutico sono alla ricerca di piccole molecole che dovrebbe inibire i segnali biologici trasmessi da questi recettori.

Ultimo ma non meno importante, la nostra ricerca conferma la nostra convinzione che alcuni degli Homo sapiens geni e proteine che stiamo scoprendo che, forse, in forma modificata, si costituiscono nuove terapie. Molte proteine di Homo sapiens sono già usati come farmaci, insulina e del fattore di coagulazione per emofiliaci sono ben noti esempi. Proteine che stimolano la produzione di cellule del sangue vengono utilizzati anche per accelerare il recupero dei pazienti 'dalla chemioterapia.

Le proteine di circa 200 del full-length sequenze del gene HGS ha scoperto sono possibili applicazioni, come i farmaci. Abbiamo fatto la maggior parte di queste proteine e hanno avviato le prove della loro attività sulle cellule. Alcuni di loro sono anche dimostrando promettenti nei test con animali da esperimento. Le proteine sono diverse chemochine, molecole che stimolano le cellule del sistema immunitario.

Farmaci in via di sviluppo non sarà mai un processo rapido, perché i farmaci, se le proteine, i geni o molecole di piccole dimensioni, devono essere testate. Tuttavia, le sequenze parziali di cDNA può accelerare la scoperta di terapie candidati. HGS permette di ricercatori accademici l'accesso a gran parte del suo database, anche se chiediamo un accordo per condividere canoni da tutti i prodotti che ne derivano.

L'utilizzo sistematico di metodi automatizzati e computerizzati della scoperta del gene ha prodotto, per la prima volta, un quadro completo del luogo in cui i geni sono diversi anatomia expressedthe di Homo sapiens espressione genica. In aggiunta, stiamo iniziando a conoscere le variazioni di espressione genica nelle malattie. E 'troppo presto per sapere esattamente quando i medici in primo luogo con successo a utilizzare queste conoscenze per trattare la malattia. Nostre analisi prevedere, tuttavia, che un certo numero di terapie risultante forma capisaldi della medicina del 21 ° secolo.

un articolo presentato dalla Donis F.

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