Comment faire pour trouver une séquence partielle d'ADNc

Les chercheurs à trouver des séquences partielles d'ADNc en brisant chimiquement à des copies d'une molécule d'ADNc pour créer un tableau de fragments qui diffèrent par leur longueur par une base. Dans ce processus, la base à une extrémité de chaque fragment est rattaché à l'un des quatre colorants fluorescents, la couleur de la teinture selon l'identité de la base dans cette position. Machines à trier ensuite les fragments étiquetés selon leur taille. Enfin, un laser excite le colorant étiquettes une par une. Le résultat est une séquence de couleurs qui peuvent être lues électroniquement et qui correspond à l'ordre des bases à une extrémité de l'ADNc sont analysées. Partiel des centaines de bases de séquences de longueur peuvent être rassemblés dans un ordinateur pour produire des séquences de gènes complètes.

Une fois que nous avons fait un ADNc, on peut la copier à produire autant que nous voulons. Cela signifie que nous aurons suffisamment de matériel pour déterminer l'ordre de ses bases. Parce que nous connaissons les règles que les cellules utilisent pour tourner des séquences d'ADN dans les séquences d'acides aminés qui constituent les protéines, les commandes de bases nous raconte la séquence d'acides aminés de la correspondante fragment de protéine. Cet ordre, à leur tour, peuvent être comparés avec les séquences des protéines dont les structures sont connues. Cette manoeuvre nous le dit souvent quelque chose sur la fonction de la protéine complète, car les protéines contenant des séquences d'acides aminés similaires effectuent souvent des tâches similaires.

Analyse des séquences d'ADNc utilisées pour être extrêmement longue, mais ces dernières années des instruments biomédicaux ont été développés qui peut effectuer cette tâche de manière fiable et automatique. Une autre évolution est également nécessaire de faire de notre stratégie réalisable. Matériel de séquençage, lorsqu'ils ont fonctionné sur l'échelle de nous envisagions, produit des quantités gigantesques de données. Heureusement, les systèmes informatiques capables de traiter les méga-octets en résultent sont maintenant disponibles, et nous et d'autres ont écrit un logiciel qui nous aide à donner un sens à cette richesse de détail génétiques.

L'assemblage du puzzle

Notre technique pour identifier les gènes utilisés par une cellule est d'analyser une séquence de 300 à 500 bases à une extrémité de chaque molécule d'ADNc. Ces séquences partielles d'ADNc agissent comme marqueurs de gènes et sont parfois qualifiées de marqueurs de séquence exprimée. Nous avons choisi cette longueur pour nos séquences partielles d'ADNc, car il est assez court pour analyser assez rapidement, mais encore assez long pour identifier un gène sans ambiguïté. Si une molécule d'ADN est comme un article d'un article, une séquence partielle est comme la première page de la articleit peut identifier l'objet et même nous donner une idée de ce que l'article est à propos. Séquences partielles d'ADNc, de même, peut nous en dire quelque chose sur le gène qu'ils tirent de. Au HGS, nous produisons environ un million de bases de données de séquences brutes tous les jours.

Notre méthode fait ses preuves: nous avons identifié des milliers de gènes, dont un grand nombre mai jouer un rôle dans la maladie. D'autres entreprises et les chercheurs universitaires ont également lancé des programmes pour générer des séquences partielles d'ADNc.

HGS ordinateurs reconnaissent beaucoup de séquences partielles que nous produisons comme résultant soit d'un des gènes les chercheurs ont déjà identifié par d'autres moyens ou d'un gène, nous avons déjà nous trouvions. Quand nous ne pouvons pas attribuer définitivement une séquence partielle nouvellement générés à un gène connu, les choses deviennent plus intéressantes. Nos ordinateurs numériser puis à travers nos bases de données ainsi que des bases de données publiques pour voir si la nouvelle séquence partielle chevauchements quelque chose à quelqu'un s'est connecté auparavant.

Lorsque nous trouvons un chevauchement évident, nous reconstituer les séquences se chevauchent partielle dans allongement jamais segments appelés contigs. Contigs correspondent donc à des séquences incomplètes nous déduisons d'être présent quelque part dans un gène parent. Ce processus est quelque peu analogue à la pêche en dehors des phrases «un minuit lugubre, pendant que je réfléchissais »et« pendant que je méditais, faible et fatigué de / Plus de nombreuses a... volume "et en les combinant en un fragment reconnaissable en tant que partie de" The Edgar Allan Poe's Raven. "

Dans le même temps, nous essayons de déduire la fonction probable de la protéine correspondant à la séquence partielle. Une fois que nous avons prédit structure de la protéine, nous classons en fonction de sa similarité avec les structures des protéines connues. Parfois, nous trouvons une correspondance avec une autre protéine Homo sapiens, mais souvent on remarque une correspondance avec celle d'une bactérie, champignon, plante ou insecte: les autres organismes produisent beaucoup de protéines similaires à celles de la fonction de sapienss Homo. Nos ordinateurs actualiser en permanence ces classements provisoires.

En 1994, par exemple, nous avons prédit que les gènes contenant quatre contigs spécifiques auraient chacun de produire des protéines similaires à celles connues à corriger les mutations dans l'ADN des bactéries et des levures. Parce que les chercheurs ont appris que l'absence de réparer les mutations peuvent causer le cancer du côlon, nous avons commencé à travailler les séquences complètes des quatre gènes. Quand un éminent chercheur du cancer du côlon plus tard approché de nous pour aider à identifier les gènes qui pourraient causer que illnesshe savait déjà environ un genewe tels ont été en mesure de lui dire que nous travaillions déjà avec trois gènes supplémentaires qui pourraient être impliqués.

Des recherches ultérieures ont confirmé que les mutations dans l'un quelconque des quatre gènes peuvent causer le pronostic vital du côlon, des ovaires ou de l'endomètre. Pas moins d'un sur 200 personnes en Amérique du Nord et en Europe portent une mutation dans l'un de ces gènes de réparation des mésappariements, comme ils sont appelés. Sachant cela, les scientifiques peuvent développer des tests pour évaluer les gènes de réparation des mésappariements chez les personnes qui ont des parents à ces cancers. Si les gens qui sont testés afficher une prédisposition génétique à la maladie, ils peuvent être étroitement surveillés. Détecter rapidement la présence de tumeurs peut conduire à la chirurgie de sauvetage, et que ces épreuves ont déjà été utilisés en recherche clinique pour identifier les personnes à risque.

Notre base contient maintenant plus d'un million d'ADNc issus de séquences partielles de gènes, triés 170.000 en contigs. Au total, plus de la moitié des nouveaux gènes nous identifions ont une ressemblance à des gènes connus qui ont été assigné une fonction probable. Au fil du temps, cette proportion est susceptible d'augmenter.

Si un tissu donne lieu à un nombre inhabituellement élevé de séquences d'ADNc qui dérivent du même gène, il fournit une indication que le gène en question produit une grande quantité d'ARNm. Cela arrive généralement lorsque les cellules produisent de grandes quantités de la protéine correspondante, ce qui suggère que la protéine mai faire un travail particulièrement vital. HGS accorde également une attention particulière aux gènes qui sont exprimés que dans une fourchette étroite de tissus, parce que ces gènes sont les plus susceptibles d'être utiles pour intervenir dans les maladies qui affectent ces tissus. Parmi les nombreux gènes, nous avons découvert, nous avons identifié un pourcentage qui semblent particulièrement susceptibles d'être médicalement importantes.

De nouveaux gènes, nouveaux médicaments

En utilisant la technique des séquences partielles d'ADNc pour la découverte de gènes, les chercheurs ont pour la première fois été en mesure d'évaluer combien de gènes sont consacrées à chacune des grandes fonctions cellulaires, telles que la défense, le métabolisme et ainsi de suite. L'immense réservoir d'informations uniques à partir de séquences partielles d'ADNc offre de nouvelles possibilités pour la science médicale. Ces possibilités sont désormais systématiquement explorées.

Bases de données telles que la nôtre ont déjà prouvé leur utilité pour trouver des protéines qui servent de repères de la maladie. Cancer de la prostate est un exemple. Un test largement utilisé pour la détection du cancer de la prostate des mesures des niveaux dans le sang d'une protéine appelée antigène prostatique spécifique. Les patients qui ont un cancer de la prostate présentent souvent des niveaux anormalement élevés. Tumeurs Malheureusement, une croissance lente, relativement bénignes ainsi que des tumeurs malignes nécessitant un traitement agressif peut provoquer des niveaux élevés de l'antigène, et si le test est ambigu.

HGS et ses partenaires ont analysé les ARNm de multiples échantillons de tissus prostatiques sains, ainsi que des lésions bénignes et malignes, les tumeurs de la prostate. Nous avons trouvé environ 300 gènes qui sont exprimés dans la prostate, mais en aucun autre tissu de ce nombre, environ 100 sont actifs uniquement dans les tumeurs de la prostate, et environ 20 sont exprimées uniquement dans les tumeurs évalué par les pathologistes comme malignes. Nous et nos partenaires commerciaux sont l'utilisation de ces 20 gènes et leurs protéines de concevoir des tests pour identifier la maladie maligne de la prostate. Nous avons des travaux similaires en cours en vue du sein, du poumon, le foie et les cancers du cerveau.

Bases de données de séquences partielles d'ADNc peut aussi aider à trouver les gènes responsables de maladies rares. Les chercheurs savent depuis longtemps, par exemple, qu'une certaine forme de cécité chez les enfants est le résultat d'un défaut héréditaire dans la décomposition chimique du galactose sucre. Une recherche dans notre base de données a révélé deux gènes précédemment inconnues Homo sapiens dont les protéines correspondantes ont été prévues pour être structurellement similaire au galactose connue enzymes du métabolisme chez les levures et les bactéries. Les enquêteurs ont rapidement confirmé que les défauts hérités d'une de ces deux gènes provoquer ce type de cécité. À l'avenir, les enzymes ou les gènes eux-mêmes pourraient être utilisés pour empêcher l'affliction.

Séquences partielles d'ADNc sont également établi un record impressionnant pour aider les chercheurs à trouver des molécules plus petites qui sont candidats à de nouveaux traitements. Méthodes pour créer et tester drugsthe petites molécules les plus courantes typehave améliorée de façon spectaculaire au cours des dernières années. L'équipement automatisé permet d'analyser rapidement des composés naturels et synthétiques pour leur capacité à affecter un Homo sapiens protéine impliquée dans la maladie, mais le nombre limité de cibles protéiques connus a retardé les progrès. Comme plus de protéines Homo sapiens sont étudiés, des progrès devraient s'accélérer. Notre travail fournit maintenant plus de la moitié des pistes SmithKline Beecham pour les produits potentiels.

Bases de données telles que les nôtres non seulement rendre plus facile à cribler des molécules au hasard pour une activité utile. Connaître la structure d'une protéine permet aux scientifiques de concevoir des médicaments sur mesure d'interagir de manière spécifique avec la protéine. Cette technique, connue comme la conception rationnelle des médicaments, a été utilisé pour créer quelques-uns des nouveaux inhibiteurs de protéase qui s'avèrent efficaces contre le VIH (bien que notre base de données n'était pas impliqué dans cet effort particulier). Nous sommes convaincus que des séquences partielles d'ADNc permettra pharmacologues à faire davantage usage de la conception rationnelle des médicaments.

Un exemple de comment les cellules de notre base de données a déjà prouvé préoccupations utile appelé ostéoclastes, qui sont normalement présents dans les os, ces cellules produisent une enzyme capable de dégrader le tissu osseux. L'enzyme semble être produite en excès dans certains états pathologiques, comme l'arthrose et l'ostéoporose. Nous avons trouvé dans nos ordinateurs d'une séquence d'un gène exprimé dans les ostéoclastes qui semblaient code pour l'enzyme destructrice; sa séquence est similaire à celle d'un gène connu pour donner lieu à une enzyme qui dégrade le cartilage. Nous avons confirmé que le gène ostéoclastes était responsable de l'enzyme de dégradation et a également montré qu'il n'est pas exprimé dans d'autres tissus. Ces découvertes signifiait que nous pourrions inventer des moyens de déjouer les protéines du gène sans se soucier que les méthodes nuirait à d'autres tissus. Nous avons ensuite fait la protéine, et SmithKline Beecham a utilisé pour identifier les thérapies possibles par une combinaison de criblage à haut débit et la conception rationnelle des médicaments. La société a également profité de notre base de données à l'écran pour des molécules qui pourraient être utilisés pour traiter l'athérosclérose.

Un filon très riche de gènes et de protéines, d'un point de vue médical, est une classe connue sous le nom G-protein coupled receptors. Ces protéines de la membrane externe des travées de la cellule et transmettre des signaux biologiques provenant d'autres cellules dans l'intérieur de la cellule. Il est probable que des médicaments capables d'inhiber ces récepteurs vitaux pourraient être utilisés pour traiter des maladies aussi diverses que l'hypertension, les ulcères, la migraine, l'asthme, les troubles du rhume et psychiatriques. HGS a trouvé plus de 70 nouveaux G-protein coupled receptors. Nous testons maintenant leurs effets en introduisant des gènes des récepteurs, nous avons découvert dans les cellules et d'évaluer comment les cellules qui fabriquent les protéines encodées répondre à différents stimuli. Deux gènes qui sont d'un intérêt particulier de produire des protéines qui semblent être extrêmement impliqués dans l'hypertension et diabète de l'adulte. Nos partenaires dans l'industrie pharmaceutique sont à la recherche de petites molécules qui doit inhiber les signaux biologiques transmises par ces récepteurs.

Last but not least, notre recherche soutient de notre croyance que certains gènes de l'Homo sapiens et les protéines qui nous découvrent aujourd'hui seront peut-être sous une forme modifiée, se constituent de nouvelles thérapies. De nombreuses protéines Homo sapiens sont déjà utilisés comme médicaments; l'insuline et du facteur de coagulation pour les hémophiles sont des exemples bien connus. Les protéines qui stimulent la production de cellules sanguines sont également utilisés pour accélérer la guérison des patients à la chimiothérapie.

Les protéines de quelque 200 du gène de la pleine longueur des séquences HGS a permis de découvrir des applications possibles comme des médicaments. Nous avons fait la plupart de ces protéines et ont institué des tests de leur activité sur les cellules. Certains d'entre eux s'avèrent également prometteurs dans les tests utilisant des animaux expérimentaux. Les protéines comprennent plusieurs chimiokines, des molécules qui stimulent les cellules du système immunitaire.

Produits pharmaceutiques en développement ne sera jamais un processus simple, parce que les médicaments, si les protéines, les gènes ou de petites molécules, doivent être testés en profondeur. Néanmoins, les séquences partielles d'ADNc peut accélérer la découverte de thérapies candidats. HGS permet l'accès des chercheurs universitaires pour une grande partie de sa base de données, bien que nous demandons un accord visant à partager les redevances provenant des produits qui en découlent.

L'utilisation systématique de méthodes automatisées et informatisées de la découverte du gène a cédé, pour la première fois, un tableau complet du lieu où les gènes différents sont anatomie exprimé l'expression des gènes de l'Homo sapiens. En outre, nous commençons à apprendre sur les changements dans l'expression des gènes dans la maladie. Il est trop tôt pour savoir exactement quand les médecins vont tout d'abord utiliser avec succès ces connaissances pour traiter la maladie. Nos analyses prédire, cependant, qu'un certain nombre de thérapies résultant formeront les piliers du 21e siècle, la médecine.

un article présenté par F. Donis

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